Kommissionens fjärde direktiv av den 5 december 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen (73/46/EEG)

Avis juridique important

Kommissionens fjärde direktiv 73/46/EEG av den 5 december 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen Europeiska gemenskapernas officiella tidning nr L 083 , 30/03/1973 s. 0021 - 0034 Finsk specialutgåva Område 3 Volym 5 s. 0115 "Grekisk specialutgåva " Område 03 Volym 9 s. 0114 Svensk specialutgåva Område 3 Volym 5 s. 0115 Spansk specialutgåva: Område 03 Volym 6 s. 0230 Portugisisk specialutgåva: Område 03 Volym 6 s. 0230

KOMMISSIONENS FJÄRDE DIREKTIV av den 5 december 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen (73/46/EEG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv av den 20 juli 1970(1) om införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella foderkontrollen, senast ändrad genom direktiv 72/275/EEG av den 20 juli 1972(2), särskilt artikel 2 i detta, och

med beaktande av följande:

Skälen nedan är grundrättsaktens. Ändringsrättsakternas skäl: direktiv 1981/680/EU · direktiv 92/89/ · direktiv 98/54/ · direktiv 1999/27/ · förordning (EG) nr 152/2009.

I det nämnda direktivet krävs att den officiella foderkontrollen skall utföras med gemenskapsmetoder för provtagning och analys i syfte att kontrollera att produkterna uppfyller de krav som framgår av bestämmelser i lagar och andra författningar som gäller kvalitet och sammansättning på foder.

I direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971(3), 71/393/EEG av den 18 november 1971(4) och 72/199/EEG av den 27 april 1972(5) har redan ett antal gemenskapsmetoder för analys fastställts. Mot bakgrund av den utveckling som därefter skett på området är det lämpligt att nu anta en fjärde metodsamling.

De åtgärder som beslutas i detta direktiv är förenliga med Ständiga foderkommitténs yttrande.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv av den 20 juli 1970 om införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella foderkontrollen, senast ändrad genom direktiv 72/275/EEG av den 20 juli 1972, särskilt artikel 2 i detta, och

I det nämnda direktivet krävs att den officiella foderkontrollen skall utföras med gemenskapsmetoder för provtagning och analys i syfte att kontrollera att produkterna uppfyller de krav som framgår av bestämmelser i lagar och andra författningar som gäller kvalitet och sammansättning på foder.

I direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971, 71/393/EEG av den 18 november 1971 och 72/199/EEG av den 27 april 1972 har redan ett antal gemenskapsmetoder för analys fastställts. Mot bakgrund av den utveckling som därefter skett på området är det lämpligt att nu anta en fjärde metodsamling.

De åtgärder som beslutas i detta direktiv är förenliga med Ständiga foderkommitténs yttande.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel1¶

Ändrad genom förordning (EG) nr 152/2009 och direktiv 1981/680/EU.

Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkontrollen då det gäller animaliska och vegetabiliska oljors och fetters vattenhalt samt halten av magnesium och råfibrer i foder skall utföras med de metoder som föreskrivs i bilaga 1 till detta direktiv.

De allmänna bestämmelser som anges i del 1 (Inledning) av bilagan till kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971 skall tillämpas på de metoder som föreskrivs i bilaga 1 till detta direktiv.

Artikel3¶

Ändrad genom förordning (EG) nr 152/2009.

Medlemsstaterna skall senast den 1 januari 1974 sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

Artikel4¶

Ändrad genom förordning (EG) nr 152/2009.

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

BILAGA 1

1. BESTÄMNING AV ANIMALISKA OCH VEGETABILISKA OLJORS OCH FETTERS VATTENHALT

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma halter av vatten och flyktiga ämnen i animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

2. Princip

Provet torkas till konstant vikt vid 103 °C. Massaförlusten bestäms genom vägning.

3. Utrustning

Flatbottnad skål av korrosionsresistent material, 8-9 cm i diameter och cirka 3 cm hög

Kvicksilvertermometer med förstärkt kula och expansionsrör i överdelen, graderad från cirka 80 °C till minst 110 °C och cirka 10 cm lång

Sandbad eller elektrisk värmeplatta

Exsickator med ett effektivt torkmedel

Analysvåg

4. Utförande

Väg med 1 mg noggrannhet upp cirka 20 g av det homogeniserade provet på den torra, vägda skålen (3.1) där termometern (3.2) placerats. Upphetta på sandbadet eller värmeplattan (3.3) under ständig omrörning med termometern så att temperaturen stiger till 90 °C på cirka sju minuter.

Sänk värmen och iaktta med vilken frekvens bubblor stiger från skålens botten. Temperaturen får inte överstiga 105 °C. Fortsätt att röra om så att skålens botten berörs tills det inte längre bildas några bubblor.

För att försäkra sig om att vattnet helt har avlägsnats upphettar man upprepade gånger till 103 °C ± 2 °C och kyler till 93 °C mellan upphettningarna. Därefter får provet svalna till rumstemperatur i exsickatorn (3.4) varefter det vägs. Detta upprepas tills massaförlusten mellan två på varandra följande vägningar inte längre överstiger 2 mg.

OBS!

Om provets massa ökar efter förnyad upphettning är detta ett tecken på att fettet har oxiderats och i detta fall skall beräkningen ske med värdet från den vägning som utfördes omedelbart innan massan började öka.

5. Resultatberäkning

Vattenhalten i procent av provet erhålls med följande formel:

M 1-M 2 · 100 M 0

där

M0 = provets massa i gram

M1 = skålens massa inklusive innehåll före upphettning

M2 = skålens massa inklusive innehåll efter upphettning

Om resultatet är lägre än 0,05 % skall detta redovisas som ”lägre än 0,05 %”.

Repeterbarhet

Skillnaden i vattenhalt mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 0,05 %, absolutvärde.

2. BESTÄMNING AV MAGNESIUM

- genom atomabsorptionsspektrometri -

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod kan mängden magnesium i foder bestämmas. Den lämpar sig särskilt för bestämning av magnesiumhalter under 5 %.

2. Princip

Provet föraskas och löses upp i utspädd saltsyra. Om det inte innehåller någon organisk substans löses det upp direkt i utspädd saltsyra. Lösningen späds ut och magnesiumhalten bestäms med atomabsorptionsspektrometri vid 285,2 nm genom jämförelse med standardlösningar.

3. Reagens

Saltsyra pa, d: 1,16

Koncentrerad saltsyra pa, d: 1,19

Magnesiumband eller -tråd eller magnesiumsulfatheptahydrat som torkats vid rumstemperatur

Strontiumsaltlösning (klorid eller nitrat) med 2,5 % strontium (vikt/volym) (= 76,08 g SrCl2 · 6H2O pa eller 60,38 g Sr (NO3)2 pa)

Standardmagnesiumlösning: väg med 1 mg noggrannhet upp 1 g magnesium (3.3), vars oxidskikt först noggrant avlägsnats, eller motsvarande kvantitet (10,143 g) magnesiumsulfatheptahydrat (3.3). Överför detta till en 1000 ml mätkolv, tillsätt 80 ml saltsyra (3.1), låt magnesiumet lösas upp och fyll på vatten till 1000 ml. 1 ml av denna lösning innehåller 1,000 mg magnesium.

4. Utrustning

Föraskningsdeglar av platina, kisel eller porslin

Elektrisk muffelugn med termostat

Atomabsorptionsspektrometer.

5. Utförande

5.1 Beredning av provlösningen

5.1.1 Foder som uteslutande består av mineralämnen

Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 g av provet i en 500 ml mätkolv med 250-300 ml vatten. Tillsätt 40 ml saltsyra (3.1), koka upp och låt koka sakta under 30 minuter. Låt svalna, fyll på vatten till full volym, blanda och filtrera över till en torr bägare genom ett torrt veckat filter. Avlägsna de första 30 millilitrarna av filtratet. Om kisel förekommer behandlas 5 g av provet med en tillräcklig kvantitet (15-30 ml) saltsyra (3.2), varefter det indunstas i vattenbad tills det torkat varefter det överförs för en timmes torkning till en ugn som är inställd på 105 °C. Fortsätt därefter enligt anvisningarna i 5.1.2 (från och med tredje meningen).

5.1.2 Foder som till övervägande del består av mineralämnen

Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 g av provet i en degel och föraska vid 550 °C i muffelugnen tills den aska som erhålls är fri från kolpartiklar och låt därefter svalna. För att avlägsna kisel tillsätts en tillräcklig kvantitet (15-30 ml) saltsyra (3.2) till askan, varpå provet får indunsta i vattenbad tills det torkat och därefter placeras i ugn vid 105 °C under en timme. Behandla återstoden med 10 ml saltsyra (3.1) och överför detta med varmvatten till en 500 ml mätkolv. Låt svalna och fyll på vatten till full volym. Blanda och filtrera över till en torr bägare genom ett torrt veckat filter. Avlägsna de första 30 millilitrarna av filtratet.

5.1.3 Foder som till övervägande del består av organiska ämnen

Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 g av provet i en degel och föraska vid 550 °C i muffelugnen tills den aska som erhålls är fri från kolpartiklar. Behandla askan med 5 ml saltsyra (3.2), indunsta i vattenbad tills provet har torkat och torka därefter under en timme i ugnen vid 105 °C så att kiseln blir olöslig. Behandla askan med 5 ml saltsyra (3.1), flytta den med varmvatten till en 250 ml mätkolv, koka upp, låt svalna och fyll på vatten till full volym. Blanda och filtrera över till en torr bägare genom ett torrt veckat filter. Avlägsna de första 30 millilitrarna av filtratet.

5.2 Mätning genom atomabsorption

Späd ut standardlösningen (3.5) med vatten så att åtminsone fem referenslösningar erhålls med stigande koncentrationer som motsvarar spektrometerns optimala mätintervall. Tillsätt 10 ml strontiumsaltlösning (3.4) till varje lösning och fyll därefter på vatten till 100 ml. Späd ut en uppmätt del av det filtrat som erhållits enligt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3 med vatten så att en magnesiumkoncentration erhålls som ligger inom intervallet för referenslösningarnas koncentrationer. Koncentrationen av saltsyra i denna lösning får inte överstiga 0,4 N. Tillsätt 10 ml strontiumsaltlösning (3.4) och fyll sedan på vatten till 100 ml. Mät absorptionen hos den lösning som skall bestämmas samt hos referenslösningarna vid 285,2 nm.

6. Resultatberäkning

Beräkna kvantiteten magnesium i provet genom jämförelse med referenslösningarna. Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 5 %, relativvärde.

3. BESTÄMNING AV VÄXTTRÅD

1. Syfte och användningsområde

Metoden gör det möjligt att bestämma sådana fettfria organiska ämnen i foder som är olösliga i sura och alkaliska media och som vanligen går under beteckningen växttråd.

2. Princip

Provet, som vid behov avfettas, behandlas i tur och ordning med kokande lösningar av svavelsyra och kaliumhydroxid i bestämda koncentrationer. Återstoden separeras genom filtrering på ett filter av sintrat glas, tvättas, vägs och föraskas vid en temperatur på 475-500 °C. Viktförlusten efter föraskningen motsvarar andelen växttråd i provet.

3. Reagens

Svavelsyra, c = 0,13 mol/l.

Skumdämpande medel (t.ex. n-oktanol).

Filtreringshjälpmedel (Celite 545 eller motsvarande), som upphettats vid 500 °C under fyra timmar (8.6).

Aceton.

Petroleumeter (kokpunkt 40-60 °C).

Saltsyra, c = 0,5 mol/l.

Kaliumhydroxidlösning, c = 0,23 mol/l.

4. Apparatur

Värmeenhet för kokning med svavelsyra eller kaliumhydroxidlösning, utrustad med hållare för filterdegeln (4.2) och försedd med ett utloppsrör med kran för utsläpp av vätska samt vakuumpump, eventuellt med tryckluft. Innan enheten tas i bruk skall den varje dag förvärmas med kokande vatten under fem minuter.

Glasfilterdegel med filterskiva av sintrat glas, porositet 40-90 μm. Före användning skall den upphettas till 500 °C under några minuter och därefter kylas (8.6).

Cylinder på minst 270 ml med återloppskylare, lämplig för kokning.

Torkugn med termostat.

Muffelugn med termostat.

Extraktionsenhet, bestående av en hållare för filterdegeln (4.2) och med ett utloppsrör med kran för utsläpp av vakuum och vätska.

Kopplingsringar för hopsättning av värmeenheten (4.1), filterdegeln (4.2) och cylindern (4.3) samt för anslutning till extraktionsenheten (4.6) och filterdegeln.

5. Utförande

Väg upp 1 g av det beredda provet med högst 0,001 g avvikelse och placera det i degeln (4.2), (se anmärkningarna 8.1, 8.2, 8.3) och tillsätt 1 g filtreringshjälpmedel (3.3).

Montera värmeenheten (4.1) och filterdegeln (4.2) och anslut därefter cylindern (4.3) till degeln. Häll 150 ml kokande svavelsyra (3.1) i cylinder/degeluppställningen och tillsätt vid behov några droppar skumdämpande medel (3.2). Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt under exakt 30 minuter.

Öppna kranen till utloppsröret (4.1) och sugfiltrera svavelsyran genom filterdegeln. Tvätta återstoden tre gånger i rad med 30 ml kokande vatten och se till att återstoden sugfiltreras torr efter varje tvättning.

Stäng utloppskranen och häll 150 ml kokande kaliumhydroxidlösning (3.7) i cylinder/degeluppställningen. Tillsätt några droppar skumdämpande medel (3.2). Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt under exakt 30 minuter. Filtrera och tvätta på samma sätt som vid behandlingen med svavelsyra.

Efter den sista tvättningen och torkningen kopplas degeln med innehåll loss och ansluts till extraktionsenheten (4.6). Tvätta återstoden i degeln tre gånger i rad med 25 ml aceton (3.4) och se till att återstoden sugfiltreras torr efter varje tvättning.

Torka degeln till konstant vikt i ugnen vid 130 °C. Låt den svalna i exsickator efter varje torkning och väg snabbt. Placera degeln i en muffelugn och föraska till konstant vikt vid 475-500 °C under minst 30 minuter.

Efter varje upphettning skall degeln först svalna i ugnen och sedan i exsickatorn innan den vägs.

Gör ett blankprov utan provet. Viktförlusten efter föraskningen får inte överstiga 4 mg.

6. Resultatberäkning

Innehållet av växttråd räknat i procent av provet framgår av formeln:

b - c × 100 a

där

a = prov i g

b = viktförlust i g efter föraskning vid bestämningen

c = viktförlust i g efter föraskning vid blankprov

7. Repeterbarhet

Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga

0,3 i absolut värde, om innehållet av växttråd är mindre än 10 %,

3 % i förhållande till det högre värdet, om innehållet av växttråd uppgår till 10 % eller mer.

8. Anmärkningar

Foder som innehåller mer än 10 % råfett skall före analys avfettas med petroleumeter (3.5). Anslut filterdegeln (4.2) med innehåll till extraktionsenheten (4.6), tvätta återstoden tre gånger i rad med 30 ml petroleumeter och se till att återstoden sugfiltreras torr. Anslut degeln med innehåll till värmeenheten (4.1) och fortsätt enligt beskrivningen i 5.

Foder som innehåller fetter som inte kan extraheras direkt med petroleumeter (3.5) skall avfettas enligt beskrivningen i 8.1 och därefter avfettas ännu en gång efter kokning med syra.

Efter kokning med syra och därpå följande tvättning ansluts degeln med innehåll till extraktionsenheten (4.6) och tvättas tre gånger med 30 ml aceton och därefter ytterligare tre gånger med 30 ml portioner petroleumeter. Sugfiltrera torrt och fortsätt analysen enligt beskrivningen i 5 och börja med kaliumhydroxidbehandlingen.

Om fodret innehåller mer än 5 % karbonat, uttryckt som kalciumkarbonat, ansluts degeln (4.2) med det uppvägda provet till värmeenheten (4.1). Tvätta provet tre gånger med 30 ml saltsyra (3.6). Låt provet vila ca en minut efter varje tillsats innan det filtreras. Tvätta en gång med 30 ml vatten och fortsätt sedan enligt beskrivningen i 5.

Om den utrustning som används utgörs av ett stativ (flera deglar anslutna till samma värmeenhet) får två enskilda bestämningar av samma analysprov inte ingå i samma provserie.

Om det efter kokningen är svårt att filtrera de sura och basiska lösningarna används tryckluft genom värmeenhetens utloppsrör, varefter filtreringen fullföljes.

Temperaturen vid föraskningen bör inte överstiga 500 °C om glasfilterdeglarna skall kunna hålla så länge som möjligt. Var noga med att undvika alltför hastiga temperaturförändringar vid uppvärmning och avkylning.

BILAGA 2

1. BESTÄMNING AV RETINOL (VITAMIN A)

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma mängden retinol (vitamin A) i foder, koncentrat och premixer. Den lägsta gränsen för bestämningen är 10000 IE/kg för starkt pigmenterade foder och 4000 IE/kg för övriga foder. Produkterna indelas i två grupper efter sin antagna retinolhalt:

Grupp A: halter under 200000 IE/kg,

Grupp B: halter på 200000 IE/kg eller mer.

2. Princip

Det varma provet hydrolyseras med en kaliumhydroxidlösning i etanolmedium och i närvaro av ett antioxidationsmedel eller i kväveatmosfär. Blandningen extraheras med 1,2-dikloretan. Extraktet indunstas tills det är torrt och behandlas med petroleumeter. Lösningen kromatograferas på enaluminiumoxidkolonn (för produkter i grupp B krävs kromatografi endast i vissa fall). För produkter i grupp A bestäms retinolet genom spektralfotometri vid 610 nm efter att ett färgat komplex utvecklats enligt Carr-Pricereaktionen; för produkter i grupp B används spektralfotometri i UV-området vid 325 nm.

3. Reagens

a) används vid analys av produkter i grupperna A och B

96-procentig etanol (volymprocent)

10-procentig natriumaskorbatlösning (vikt/volym) pa, eller

renat kväve

50-procentig kaliumhydroxidlösning (vikt/volym) pa

Kaliumhydroxidlösning 1 N pa

Kaliumhydroxidlösning 0,5 N pa

1,2-dikloretan pa

Petroleumeter, kokintervall 30-50 °C. Rena, om så är nödvändigt, på följande sätt: rör om 1000 ml petroleumeter med satser om 20 ml koncentrerad svavelsyra tills syran förblir färglös. Avlägsna syran och skölj petroleumetern i tur och ordning med 500 ml vatten, två gånger med 10-procentig natriumhydroxidlösning (vikt/volym) och tre gånger med 500 ml vatten. Avlägsna vattenskiktet, torka petroleumetern under en timme över aktivt kol och vattenfritt natriumsulfat, filtrera och destillera.

Aluminiumoxid, standardiserad enligt Brockmann: föraska under åtta timmar vid 750 °C, kyl i exsickator och förvara i brun glasflaska med propp av matterat glas. Fukta på följande sätt innan aluminiumoxiden används för kromatografi: placera 10 g aluminiumoxid och 0,7 ml vatten i en brun glasflaska, tillslut med propp och upphetta under fem minuter i kokande vattenbad samtidigt som flaskan skakas om. Låt svalna. Kontrollera aktiviteten hos det på detta sätt preparerade aluminiumet genom att låta en känd kvantitet retinol (3.17) (cirka 500 IE) behandlas enligt 5.3 och 5.4 varefter återhämtningen kontrolleras.

Basisk aluminiumoxid, aktivitetsgrad 1 (Woelm, Merck eller motsvarande)

Ren dietyleter. Avlägsna peroxider och spår av vatten genom kromatografi mot en kolonn basisk aluminiumoxid (3.10). (25 g aluminiumoxid till 250 ml dietyleter)

Petroleumeterlösningar (3.8) med 4, 8, 12, 16 och 20 % (volymprocent) dietyleter (3.11)

Natriumsulfidlösning 0,5 molar i 70-procentig glycerin (volymprocent), beredd av natriumsulfid pa

b) används uteslutande vid analys av produkter i grupp A

Kristalliserbar bensen pa

Kloroform pa. Avlägsna etanol, fosgen och spår av vatten genom kromatografi mot en kolonn basisk aluminiumoxid (3.10) (50 g aluminiumoxid till 200 ml kloroform; de första 50 ml eluat bör kromatograferas en andra gång).

Carr-Pricereagens: rör om cirka 25 g antimontriklorid pa (förvarad i exsickator) med 100 ml kloroform (3.15) tills lösningen är mättad. En viss antimontrikloridfällning utgör inget problem. Tillsätt 2 ml ättiksyraanhydrid pa. Förvara i kylskåp i brun glasflaska med propp av matterat glas. Lösningen är hållbar i flera veckor.

Retinol, spektralfotometriskt standardiserad

c) används uteslutande vid analys av produkter i grupp B

Isopropanol till kromatografi

4. Utrustning

Vattenbad

Vakuumindunstningsutrustning med runda kolvar med olika rymd

Glasrör för kromatografi (längd: 300 mm; inre diameter: cirka 13 mm)

Spektralfotometer med 10 mm celler. Vid mätningar inom UV-området krävs kiselceller.

UV-lampor som är lämpliga för 365 nm

5. Utförande

OBS!

Samtliga operationer måste utföras skyddat från direkt ljus, om så är nödvändigt med utrustning av brunt glas.

5.1 Analysprov

Av det fint sönderdelade provet tas en del för analys i proportion till den antagna retinolhalten enligt följande:

0,1-1,0 g av koncentrat (halter över 20000 IE/g),

3,0-5,0 g av premixer (halter mellan 400 och 20000 IE/g),

10-20 g av mineralblandningar,

30 g av produkter i grupp A.

Placera analysprovet omedelbart i en 500 ml kolv med propp av matterat glas.

5.2 Hydrolys och extraktion

Tillsätt i tur och ordning till analysprovet 40 ml etanol (3.1), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.2), 10 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.13).

Upphetta under 30 minuter vid 70-80 °C under återloppskylare och låt sedan svalna under rinnande vatten. Tillsätt 50 ml etanol (3.1) och 100 ml 1,2-dikloretan (3.7) (använd pipett). Skaka om kraftigt och dekantera därefter supernatanten i en dekanteringsbehållare. Tillsätt till denna 150 ml kaliumhydroxidlösning (3.5), skaka om under 10 sekunder och låt stå tills skikten är separerade. Samla in dikloretanskiktet (det lägsta skiktet) i en dekanteringsbehållare, tillsätt 40 ml kaliumhydroxidlösning (3.6), skaka om under 10 sekunder och låt stå tills skikten är separerade. Samla in dikloretanskiktet i en dekanteringsbehållare och skölj 6-8 gånger med 40 ml vatten per gång tills det är alkalifritt (fenolftaleintest). Samla in dikloretanskiktet och avlägsna de sista spåren av vatten med remsor av filterpapper.

Indunsta en uppmätt del av lösningen under vakuum i vattenbad vid 40 °C tills den är torr. Behandla skyndsamt återstoden med 5 ml petroleumeter (3.8).

Produkter i grupp A: kromatografera enligt anvisningarna i 5.3.1.

Produkter i grupp B: flytta lösningen till en 50 ml mätkolv, fyll på petroleumeter (3.8) till full volym, blanda och mät den optiska densiteten enligt anvisningarna i 5.4.2.

5.3 Kromatografi

5.3.1 Produkter i grupp A

Fyll ett kromatografirör (4.3) till 200 mm höjd med 10 g aluminiumoxid (3.9) som dessförinnan uppslammats i petroleumeter (3.8). Placera den lösning som erhållits enligt 5.2 i röret och tillsätt omedelbart 20 ml petroleumeter (3.8). Eluera i tur och ordning med10 ml-satser av lösningarna av petroleumeter i 4, 8, 12, 16 och 20 % dietyleter (3.12) under tryck eller partiellt vakuum med en flödestakt på 2-3 droppar per sekund.

Karotinet elueras först Retinolen elueras vanligen med lösningen av petroleumeter i 20 % dietyleter (3.12). Elueringen iakttas i UV-ljus (kort belysning av kolonnen med kvicksilverlampan). Den fluorescerande retinolzonen är klart skild från de gula xantofyllzoner som följer efter den. Samla in den del av eluatet som innehåller retinolen i en Erlenmayerkolv.

5.3.2 Produkter i grupp B

Kromatografi är endast nödvändig om de mätvärden av den optiska densiteten som erhålls enligt 5.4.2 inte motsvarar de krav som anges där.

Om det visar sig nödvändigt att använda kromatografi placeras en uppmätt del av den lösning i petroleumeter som erhållits enligt 5.2 med en retinolhalt av cirka 500 IE i kromatografiröret varefter kromatografin utförs enligt 5.3.1.

5.4 Mätning av den optiska densiteten

5.4.1 Produkter i grupp A

Indunsta under vakuum det eluat med retinolen som erhållits enligt 5.3.1 tills det är torrt. Behandla återstoden med 2 ml bensen (3.14). Ta 0,3 ml av denna lösning och tillsätt 3 ml Carr-Pricereagens (3.16). En blå färgton utvecklas. Mät den optiska densiteten med spektralfotometern vid 610 nm exakt 30 sekunder efter att reaktionen har börjat. Bestäm retinolhalten genom jämförelse med en standardkurva som erhållits med bensenlösningar med ökande koncentrationer av standardretinol som behandlats med Carr-Pricereagens (2-16 IE standardretinol (3.17) till 0,3 ml bensen (3.14) + 3 ml Carr-Pricereagens (3.16)). Standardkurvan måste kontrolleras ofta och regelbundet med hjälp av standardretinol och en nyberedd Carr-Pricereagenslösning.

5.4.2 Produkter i grupp B

Ta en uppmätt del av den lösning i petroleumeter som erhållits enligt 5.2 med en retinolhalt av cirka 200 IE. Indunsta under vakuum tills lösningen blivit torr och behandla återstoden med 25 ml isopropanol (3.18). Mät den optiska densiteten i spektralfotometern vid 325, 310 och 334 nm. Absorptionsmaximum ligger vid 325 nm. Lösningens retinolhalt beräknas på följande sätt:

E325 · 18,30 = IE retinol/ml

Kvoten av de optiska densiteterna

E310: E325 och E334: E325

måste dock vara 6 : 7 = 0,857.

Om någon av dessa kvoter skiljer sig väsentligt från detta värde (< 0,830 eller > 0,880) måste mätningen av de optiska densiteterna föregås av kromatografi med den metod som anges i 5.3.2. Om den mätning av de optiska densiteterna som utförs efter kromatografin visar att de ovannämnda kvoterna fortfarande skiljer sig väsentligt från värdet 0,857 (< 0,830 eller > 0,880) måste bestämningen utföras med den metod som angetts för produkter i grupp A.

6. Resultatberäkning

Beräkna provets retinolhalt med beaktande av analysprovets vikt och de utspädningar som utförts under analysen. Uttryck resultaten i IE retinol per kg foder, koncentrat eller premix.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:

20 %, relativvärde, för retinolhalter under 75000 IE/kg,

15000 IE för halter mellan 75000 och 150000 IE/kg,

10 %, relativvärde, för halter mellan 150000 och 250000 IE/kg,

25000 IE för halter mellan 250000 och 500000 IE/kg,

5 %, relativvärde, för halter över 500000 IE/kg.

2. BESTÄMNING AV TIAMIN (VITAMIN B1, ANEURIN)

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma mängden tiamin (aneurin, vitamin B1) i foder, koncentrat och premixer. Lägsta gräns för bestämningen är 5 ppm.

2. Princip

Det varma provet behandlas med utspädd svavelsyra varefter det enzymhydrolyseras. Den lösning som erhålls får genomgå basisk oxidation. Det tiokrom som bildas extraheras med isobutanol och bestäms genom fluorometri.

3. Reagens

100 μg/ml standardtiaminlösning: lös upp 112,3 mg tiaminhydroklorid, som vakuumtorkats till konstant vikt, i 1000 ml svavelsyra 0,2 N (3.2). Om denna lösning förvaras svalt och i skydd för ljus är den hållbar i en månad.

Svavelsyra 0,2 N

Ren natriumbisulfit

20-procentig kaliumferrocyanidlösning pa (vikt/volym)

25-procentig kaliumhydroxidlösning pa (vikt/volym)

Oxiderande blandning: blanda 2 ml kaliumferrocyanidlösning (3.4) med 48 ml kaliumhydroxidlösning (3.5). Denna lösning är endast hållbar i fyra timmar.

Isobutanol pa

Natriumacetatlösning 2,5 N

Flerenzymsberedning som innehåller proteas, fosfatas och amylas (t.ex. Clarase)

96-procentig etanol (volymprocent)

4. Utrustning

Vattenbad

Centrifug (3500 varv per minut) med 30-50 ml rör som är försedda med proppar av matterat glas

Fluorometer

5. Utförande

5.1 Enzymhydrolys

I två 250 ml mätkolvar, A och B, placeras identiska mängder av det fint sönderdelade provet med ett innehåll av cirka 100 μg tiamin och 125 ml svavelsyra (3.2). Tillsätt även, men endast till kolv A, 1,0 ml standardlösning (3.1) (intern standard).

Skaka om kolvarna kraftigt, placera dem i kokande vattenbad under 15 minuter och skaka om några gånger under denna tid. Låt svalna till cirka 45 °C. Tillsätt 20 ml natriumacetatlösning (3.8) och 0,5 g flerenzymsberedning (3.9) till var och en av kolvarna och låt dem därefter stå 20 minuter i rumstemperatur. Tillsätt 20 ml natriumacetatlösning (3.8), fyll på vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Ta vara på filtraten A och B efter att de första 15 millilitrarna avlägsnats. Bered följande lösningar:

5.1.1 Referenslösning T

Placera 5 ml filtrat A och cirka 10 mg natriumbisulfit (3.3) i ett centrifugrör (4.2). Sänk ned röret i kokande vattenbad under 15 minuter och låt därefter svalna till rumstemperatur.

5.1.2 Lösning A (intern standard) och B (prov)

Placera 5 ml filtrat A i ett centrifugrör (4.2) och 5 ml filtrat B i ett centrifugrör (4.2).

5.2 Oxidation

Tillsätt till lösningarna T, A och B 5 ml oxiderande blandning (3.6) och en minut senare 10 ml isobutanol (3.7). Tillslut rören och skaka om kraftigt under fem sekunder. Låt stå under en minut och centrifugera så att skikten separeras. Överför från varje rör 5 ml av dekanteringsskiktet isobutanol till var och en av 25 ml mätkolvarna, fyll på etanol (3.10) till full volym och homogenisera (=extrakt T, A och B).

5.3 Fluorescensmätning

Utför mätningarna vid den våglängd där fluorometern ger optimalt utslag för tiokromets fluorescens. Bestråla vid cirka 365 nm.

Nollställ instrumentet för extrakt T. Mät fluorescensintensiteten hos extrakten A och B.

6. Resultatberäkning

Provets tiaminhalt i mg/kg erhålls med formeln:

a · b a-b c

där

a = fluorescensintensiteten hos extrakt A (intern standard),

b = fluorescensintensiteten hos extrakt B (prov),

c = analysprovets vikt i gram,

d = mängd tiamin i μg som tillsatts till analysprovet (intern standard).

Repeterbarhet

Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga

10 %, relativvärde, för halter under 500 mg/kg, och

5 %, relativvärde, för halter på 500 mg/kg eller mer.

3. BESTÄMNING AV ASKORBINSYRA OCH DEHYDROASKORBINSYRA (VITAMIN C)

1. Syfte och räckvidd

Med denna metod är det möjligt att bestämma den totala mängden askorbinsyra och dehydroaskorbinsyra (vitamin C) i foder, koncentrat och premixer. Den lägsta gränsen för bestämningen är 5 ppm. Produkterna indelas i två grupper efter sin antagna C-vitaminhalt:

Grupp A: halter under 10 g/kg,

Grupp B: halter på 10 g/kg eller mer.

2. Princip

Provet slammas i utspädd metafosforsyralösning och extraheras med kloroform. Vattenfasen behandlas med 2,6-diklorfenol-indofenollösning för att omvandla askorbinsyran till dehydroaskorbinsyra och därefter med 2,4-dinitrofenylhydrazinlösning. Det hydrazon som bildas extraheras med en blandning av etylacetat, isättiksyra och aceton. Lösningen kromatograferas mot en kiselgelkolonn, eluatet indunstas tills det är torrt och återstoden löses upp i utspädd svavelsyra. Lösningens optiska densitet mäts med spektralfotometer vid 509 nm.

Då det gäller produkter i grupp A genomgår det eluat som bildas vid kromatografi på kolonnen dessutom tunnskiktskromatografi för att isolera hydrazonet.

3. Reagens

Standardlösning L-askorbinsyra, 0,05 %: lös upp 50 mg L-askorbinsyra pa i cirka 20 ml metafosforsyralösning (3.2) och fyll på vatten till 100 ml. Bered lösningen omedelbart före användning.

10-procentig metafosforsyralösning (vikt/volym): mal 200 g metafosforsyra pa i mortel och lös därefter upp detta i vatten samt fyll på vatten till 2000 ml. Förvara vid 4 °C. Lösningen är stabil i en vecka.

Kloroform pa.

0,5-procentig lösning av 2,6-diklorfenol-indofenol pa (vikt/volym). Bereds omedelbart före användning.

Filtrermedel (S. och S. nr 121 eller motsvarande).

2-procentig syralösning av 2,4-dinitrofenylhydrazin (vikt/volym): lös upp 2 g 2,4- dinitrofenylhydrazin i 100 ml utspädd svavelsyra (25 ml svavelsyra pa, d: 1,84, utspädd genom att vatten fyllts på till 100 ml). Om denna lösning förvaras svalt är den hållbar i en vecka.

Kväve, eller

koldioxid.

Blandning etylacetat pa/isättiksyra/aceton pa i volymproportionerna 96/2/2.

Blandning diklormetan pa/isättiksyra i volymproportionerna 97/3.

Kiselgel, partikelstorlek: 0,05-0,2 mm.

Kiselgel H, Stahlkvalitet, för tunnskiktskromatografi.

Utspädd svavelsyra: fyll 105 ml vatten i en 200 ml mätkolv och fyll på svavelsyra pa, d: 1,84, till full volym.

Eluerande lösningsmedel för tunnskiktskromatografi: blanda 75 ml dietyleter pa, 25 ml etylacetat pa och 4,0 ml 96-procentig isättiksyra pa (vikt/volym). Efter 2-3 kromatografier skall ny lösning användas.

4. Utrustning

Vattenbad med termostat inställd på 20 °C.

Centrifug (3500 varv per minut) med 40-50 millilitersrör med proppar av matterat glas.

Vakuumrotationsindunstare med 250 ml kolvar.

Glasrör för kromatografi (längd: 100 mm, inre diameter: 20 mm) med sintrad skiva (t.ex. Allihnrör).

Spektralfotometer eller kolorimeter med filter med 10 mm celler.

Apparatur för tunnskiktskromatografi med kiselgelplattor (3.12) täckta med ett 0,5-0,6 mm tjockt lager. (Det är lämpligast att använda färdigtillverkade plattor.) Torka plattorna under 2½-3 timmar i torkugnen vid 120-130 °C. Låt svalna och förvara dem därefter i exsickatorn under minst 24 timmar före användning.

Torkugn inställd på 120-130 °C.

5. Utförande

5.1 Extraktion

I två 250 ml mätkolvar (med proppar av matterat glas), A och B, placeras identiska mängder av det fint sönderdelade provet med ett C-vitamininnehåll av cirka 200 μg. Tillsätt endast till kolv A 0,4 ml standardlösning (3.1) och blanda under försiktig omskakning (intern standard).

Tillsätt till vardera kolven 30 ml kloroform (3.3) och 25 ml metafosforsyralösning (3.2) med en temperatur av 4 °C. Skaka om hastigt och låt därefter stå under 10-15 minuter. Tillsätt 25 ml vatten, tillslut kolvarna, skaka om kraftigt under 10 sekunder och placera dem i vattenbadet (4.1) under 10-15 minuter. Centrifugera, så att vattenfasen skiljs från kloroformfasen. Utför de operationer som beskrivs nedan samtidigt på de vattenhaltiga extrakten A (intern standard) och B.

5.2 Oxidation

Flytta med pipett 40 ml av den lätt grumliga vattenlösning som erhålls som dekanteringsvätska (5.1) till ett reaktionsrör med propp av matterat glas, tillsätt 0,5-1 ml 2,6-diklorfenol- indofenollösning (3.4) och blanda. En röd färgton utvecklas som bör kvarstå i minst 15 minuter. Tillsätt därefter cirka 300 mg filtrermedel (3.5), skaka om och filtrera genom ett torrt veckat filter. Filtratet behöver inte nödvändigtvis vara klart.

5.3 Reaktion med 2,4-dinitrofenylhydrazin och hydrazonextraktion

Flytta med pipett 10 ml av det filtrat som erhålls enligt 5.2 till ett centrifugrör (4.2), tillsätt 2 ml 2,4-dinitrofenylhydrazinlösning (3.6) och blanda. Sänd snabbt en ström kväve (3.7) eller koldioxid (3.8) in i röret, tillslut det och sänk ned det under cirka 15 timmar (över natten) i vattenbadet (4.1).

Tillsätt därefter 3 ml vatten, 20 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9) och cirka 800 mg filtrermedel (3.5). Tillslut röret, skaka om kraftigt under 30 sekunder och centrifugera. Placera 15 ml av supernatantfasen i en indunstningskolv och indunsta under reducerat tryck i rotationsindunstaren (4.3) tills en oljig återstod erhålls. Lös upp återstoden i 2 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9) genom att på nytt värma till 50 °C, låt svalna, tillsätt 10 ml diklormetan/isättiksyrablandning (3.10) och blanda.

5.4 Kromatografi mot kolonn

Fyll ett kromatografirör (4.4) till 30 mm-markeringen med diklormetan/isättiksyrablandningen (3.10). Slamma (genom kraftig omskakning) 5 g kiselgel (3.11) i 30 ml diklormetan/isättiksyrablandning (3.10) och häll suspensionen i röret. Låt stå och komprimera därefter med kväve (3.7) vid lågt tryck. Dekantera den lösning som erhållits enligt 5.3 i röret, skölj kolven med en liten kvantitet diklormetan/isättiksyrablandning (3.10) och dekantera i röret och fyll därefter detta med blandningen (3.10) varefter kolonnen sköljs med samma blandning (3-4 satser om cirka 5 ml) tills ett färglöst eluat erhålls. Avlägsna den del av eluatet som är gulfärgad.

Eluera den rödaktiga zonen högst upp på kolonnen med etylacetat/isättiksyra/acetonblandningen (3.9), samla in eluatet och indunsta tills det är torrt.

Produkter i grupp A (C-vitaminhalter under 10 g/kg): lös upp återstoden i 2,0 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9) och kromatografera omedelbart mot ett tunt skikt enligt 5.5.

Produkter i grupp B (C-vitaminhalter på 10 g/kg eller mer): behandla den oljiga återstoden med 4,0 ml utspädd svavelsyra (3.13), skaka om kraftigt så att återstoden helt löses upp och mät den optiska densiteten enligt 5.6.

5.5 Tunnskiktskromatografi

De operationer som beskrivs i det följande skall utföras parallellt vid två samtidiga försök. Placera 0,5 ml av den lösning som erhållits enligt 5.4.1 i en tunn linje på plattan (4.6). Använd det eluerande lösningsmedlet (3.14) för att framkalla under minst 20 minuter i en vanna som är mättad med ånga från lösningsmedlet tills den rosafärgade hydrazonzonen separerats tydligt. Låt lufttorka. Markera gränsen för den rosafärgade zonen, skrapa av den med spatel och flytta allt pulver utan spill till ett kromatografirör (4.4).

Eluera i tur och ordning först en gång med 2 ml och därefter två gånger med 1,5 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9). Samla in eluatet i en liten kolv (den sista delen måste vara färglös). Indunsta tills det är torrt, behandla den oljiga återstoden med 4,0 ml utspädd svavelsyra (3.13), skaka om kraftigt så att återstoden löses upp fullständigt och mät den optiska densiteten.

5.6 Mätning av den optiska densiteten

Mät den optiska densiteten med spektralfotometer vid 509 nm 20-30 minuter efter att återstoden lösts upp i svavelsyra. Utför mätningarna genom jämförelse med utspädd svavelsyra (3.13).

5.7 Blankprov

Utför ett blankprov med samma metod men med uteslutande av provet.

6. Resultatberäkning

Provets C-vitaminhalt i g per kg erhålls med formeln:

c-a · 2 b-c · 10d

där

a = blankprovets optiska densitet

b = den interna standardlösningens optiska densitet

c = provlösningens optiska densitet

d = analysprovets vikt i gram.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:

10 %, relativvärde, för C-vitaminhalter under 10 g/kg, och

5 %, relativvärde, för halter på 10 g/kg eller mer.

1 EGT nr L 170, 3.8.1970,

2 EGT nr L 171, 29.7.1972, s. 39.

3 EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.

4 EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7.

5 EGT nr L 123, 29.5.1972, s. 6.

6 IE = 0,3 μg retinol.

7 För mjölkfoder och produkter med tendens att agglomerera eller svälla, skall mängden av de reagens som upptas i 5.2, första och andra stycket, dubbleras.

8 Natriumaskorbat behöver inte tillsättas när hydrolysen utförs i kväveatmosfär.

9 Karotinhalten kan beräknas genom mätning av den optiska densiteten vid 450 nm; E 1 % 1 cm = 2600.